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透射荧光显微镜与反射荧光显微镜的区别及优缺点
发布时间:2016-10-27   点击次数:4079次

1.透射式荧光显微镜:激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器,也可用普通集光器,调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上.这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强,而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱.所以对观察较大的标本材料较好。

2.落射式荧光显微镜:这是近代发展起来的新式荧光显微镜,与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面,即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个双色束分离器,它与光铀呈45度角,激发光被反射到物镜中,并聚集在样品上,样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜,反回到双色束分离器,使激发光和荧光分开,残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片/双色束分离器/阻断滤片的组合插块,可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀,成像清晰,放大倍数愈大荧光愈强。

透射荧光显微镜的优点及缺点

光源:高压汞灯或卤素灯。

聚光镜:使用暗场聚光镜,使激发光和荧光分离出来。

物镜:可用任何种类的物镜。

标本:因为是透射观察,薄的标本比较适合。

优点:①由于用了暗场聚光镜,激发光不能进入物镜,因此容易形成暗的背景,得到良好的反差,且任何物镜都可用于观察。②用低倍物镜时,比反射荧光显微镜更亮。

缺点:必须正确调整聚光镜中心和高度,否则不能获得明亮的荧光像。由于暗视场聚光镜焦距限制,不能使用厚的载玻片。视场照明区不能过大,否则容易使荧光标本荧光色衰褪。厚的或不透明的标本不适用。

反射荧光显微镜的优点及缺点
光源:高压汞灯或卤素灯。

聚光镜:因为物镜作为聚光镜,所以不需要聚光镜。

物镜:所用物镜必须能透过足够的紫外光,而且本身不产生荧光,对数值孔径没有限制。

标本:厚的标本或不透明的标本都能观察。

优点:①由于物镜兼作聚光镜,不需要很多调节。②采用柯拉照明法,可利用孔径光阑和视场光阑的效果。③物镜数值孔径不受限制,在高放大倍率时,也可以获得高分辨率的像。④厚的或不透明的标本也能观察,厚的盖玻片也能使用。⑤其它观察法也能与反射荧光结合使用,特别和相差法和透射微分干涉差法相结合。⑥可以避免不必要的荧光色衰褪现象。

缺点:在用地倍率物镜时,像比较暗,因此必须用大数值孔径的物镜。滤光镜系统必须有效地分离开激发光和荧光。

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